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基于数据挖掘和网络药理学的中药抗血栓用药规律分析
摘 要：目的 深静脉血栓是新型冠状病毒肺炎（coronavirus disease2019，COVID-19）危重症患者病亡和预后不佳的重要原因，挖掘中医药防治血栓的组方用药规律，为中医药用于防治COVID-19危重症患者出现深静脉血栓提供参考。方法 以中国知网和万方数据库收录的相关文献为资料来源，使用Excel2010、Clementine12.0软件，对纳入标准的中药进行关联规则分析，运用网络药理学的方法对核心药物组合进行基因本体（geneontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia ofgenes and genomes，KEGG）富集分析，研究其作用机制并借助分子对接加以验证。结果 从中国知网和万方数据库中筛选出抗血栓方剂356个，发现25味高频中药，进一步关联分析得到7个高频药物组合。其中，核心药物组合“红花-桃仁-赤芍-川芎”的有效化学成分23个，核心药物组合与血栓的交集靶点41个，PPI网络主要涉及IL-6、VEGFA、CASP3、ALB、EGFR、MAPK8等关键靶蛋白，GO功能富集分析，得到生物过程条目971个（P＜0.05），KEGG富集得到105条通路（P＜0.05），主要涉及卡波济氏肉瘤疱疹病毒感染、人巨细胞病毒感染、流体剪切力和动脉粥样硬化、乙型肝炎等通路；分子对接筛选得到与IL-6结合能力较好的活性成分是木犀草素、槲皮素、黄芩素。结论 核心药物组合中的关键活性成分可通过调控IL-6等关键靶点，借助卡波济氏肉瘤疱疹病毒感染、人巨细胞病毒感染、流体剪切力和动脉粥样硬化、乙型肝炎等通路发挥抗血栓作用，为新冠肺炎危重症患者出现深静脉血栓的预防和治疗提供参考。
1 资料与方法
1.1 数据来源
1.2 纳入标准
①文献须为临床病例（不区分是否为随机对照试验）；②文献与中药复方抗血栓相关；③文献中的复方包含完整药物组成；④文献须涉及D-二聚体纤维蛋白原（fibrinogen，Fbg）、凝血酶原时间（prothrombin time，PT）、凝血酶时间（thrombin time，TT）、活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time，APTT）等体现抗栓效果的生化指标或彩色多普勒超声检查；⑤样本数大于等于10。
1.3 排除标准
1.4 数据分析
使用Clementine12.0对纳入标准的中药进行网络化可视分析展示，并利用Apriori建模进行关联规则分析[10]；使用R语言3.6.2程序基于“bioconductor”数据包提取信息；对核心药物组合抗血栓的潜在作用靶标进行基因本体（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析；使用Cytoscape软件构建“疾病-药物-活性成分-靶点”网络图和活性成分与疾病共同靶点的蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-protein interactions，PPI）网络，从RSCB数据库中下载关键靶蛋白的晶体结构，使用AutoDockTools 1.5.6软件将晶体结构中的水分子删除，进行加氢处理，并且对蛋白质进行电荷计算，最后保存为pdbqt格式文件，从PubChem数据库中下载筛选出的关键活性化合物3D结构的SDF格式文件，利用Chem3D 17.0软件和PyMOL进行蛋白小分子结构处理，再上传化合物文件使其能量最小化，最后运用AutoDock vina软件进行分子对接，用PyMOL软件对结果进行可视化[11]。
2 结果与分析
2.1 数据筛选
依据上述纳入及排除标准，筛选出符合标准的文献337篇，将文献中方剂的基本方进行录入处理，加减药物舍去，整理后共得到356首方剂。数据库检索及文献、方剂删选的具体流程见图1[12]。
2.2 单味中药使用情况
参照《中国药典》2015年版[13]和《中药学》[14]对356首方剂中的药物名称进行统一，共计出现198种中药，累计出现频率3482次，取用药频次在前10%作为高频药物[15]，共包含25种中药（频次≥38），累计频次2437次（占总频次的69.99%），使用频数较高的前6味中药分别是当归（频次224，62.92%）、红花（频次205，57.58%）、川芎（频次201，56.46%）、赤芍（频次188，52.81%）、桃仁（频次173，48.60%）、牛膝（频次165，46.35%），见表1。
2.3 高频药物关联规则分析
Apriori算法是关联规则挖掘的经典算法，其基于2步频率集的思想，利用递推方法分析频繁项集中隐匿的关联规则[16-17]，在Clementine 12.0软件中对高频药物（使用频次≥38）进行关联规则分析，利用Apriori建模，设置支持度为20，置信度为90%，最大前项数为5，提升度≥1等条件[18]，在356首方剂中挖掘出7个潜在药物组合，潜在药物组合的提升度均大于1，说明这些药物组合在统计学上均有意义[17]，置信度和提升度最高的核心药组为红花-桃仁-川芎-当归，具体参数见表2。高频药物间的关联网络展示图见图2。
2.4 关联药物用量情况
为确保关联药物组合防治COVID-19的DVT临床用药的准确性、有效性，本研究对得到的关联药物组合中涉及的中药进行用量统计分析，发现当归、桃仁、红花、赤芍、川芎的主要用量区间均在10～15 g，牛膝的主要用量区间为10～18 g（表3）。
2.5 基于网络药理学核心药物组合抗血栓的机制分析
2.5.1 核心药物组合活性成分、作用靶点及血栓作用靶点信息收集 红花-桃仁-赤芍-川芎是所得置信度和提升度最高的核心药物组合，在中药系统药理学数据库分析平台（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）检索红花、桃仁、赤芍、川芎4味中药的活性成分和作用靶点，并根据口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%以及类药性（drug- likeness，DL）≥0.18[19]，除去重复项和未存在的映射关系，筛选出46个化学成分、109个作用靶点。通过GeneCards数据库（https://www. genecards.org/）获取血栓的相关靶标，得到798个作用靶点。
2.5.2 疾病-药物-活性成分-靶点网络和PPI网络分析 通过Venn图得到4味中药的活性成分与疾病的交集靶点41个，利用STRING（https://string-db. org/）数据库获取蛋白互作关系，最后利用Cytoscape软件构建疾病-药物-活性成分-靶点网络（图3）和PPI网络（图4），使用R包制作靶蛋白Barplot图（图5）。疾病-药物-活性成分-靶点网络图包含69个节点（41个靶基因、23个药物活性成分、4个中药名和1个疾病名），其中槲皮素、β-谷甾醇、黄芩素、木犀草素、山柰酚、豆甾醇是对应靶标最多的化学成分，见表3。PPI网络图中靶蛋白之间作用关系的强弱与靶蛋白对应圆的大小、颜色深浅以及蛋白之间连线的粗细、颜色深浅呈正相关，靶蛋白Barplot图将PPI网络中每个靶蛋白所连接节点的数量用柱状图的形式展示，连接的节点越多代表与其他靶蛋白之间的互作关系越强，最终发现作用强度较强的靶蛋白（节点数目＞25）是白细胞介素-6（intedeukin-6，IL-6）、血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、胱天蛋白酶3（caspase-3，CASP3）、血清白蛋白（albumin，ALB）、表皮生长因子受体（epithelial growth factor receptor，EGFR）、丝裂原激活蛋白激酶8（mitogen-activated protein kinase 8，MAPK8）。
2.5.3 GO功能富集与KEGG通路富集分析 通过数据库（https://org.Hs.eg.db）对核心药物组合抗血栓作用靶标进行GO和KEGG富集分析，通过R语言的ClusterProfilerGO.R运行包得到生物功能和通路富集分析的高级气泡图（前20条），其中点越大则富集基因越多，P值越小颜色越红，代表与核心药物组合防治血栓关系越密切[11]。通过GO分析得到971条生物过程（biological process，BP），主要涉及氧化应激反应、解剖结构稳态、细胞对氧化应激的反应、对脂多糖的反应、对酸性化学物质的反应、对细菌源分子的反应等生物过程。通过KEGG通路富集得出105条信号通路（P＜0.05），主要涉及卡波济氏肉瘤疱疹病毒感染、人巨细胞病毒感染、流体剪切力和动脉粥样硬化、乙型肝炎等通路（图6、7）。
2.6 分子对接验证核心药物组合抗血栓共有活性成分与核心靶点间的相互作用
将核心药物组和中作用靶点最多的化学活性成分与PPI网络中连接节点数目最多的核心靶蛋白IL-6进行分子对接（表4），从而对网络药理学所得结果加以验证。分子对接中结合能小于0提示配体与受体可自发结合[20]，且结合构象越稳定结合能越低，小分子化合物与蛋白发生作用的可能性越大[21]，本研究选取结合能≤−20 kJ/mol作为筛选条件[12]，对接结果显示，6种活性成分均能与IL-6结合，对接情况见图8，其中木犀草素、槲皮素、黄芩素结合活性较好。
3 讨论
综上，本研究基于数据挖掘和网络药理学对中医药抗血栓的组方用药规律及其作用机制进行探讨，发现核心药物组合（红花-桃仁-赤芍-川芎）中的关键活性成分可通过调控IL-6等关键靶点，借助与病毒感染及炎症血管性疾病相关通路，对抗氧化应激反应，修复血管内皮损伤，抑制血小板聚集，发挥抗血栓作用，为COVID-19危重症患者出现DVT的预防和治疗提供数据支撑与理论指导。
来 源： 崔琳琳，苗明三．基于数据挖掘和网络药理学的中药抗血栓用药规律分析 [J]. 中草药, 2021, 52(4):1063 -1072 .
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